ProteoStat 蛋白聚集检测

　　某些肽链在经过错误折叠后很容易形成聚集，在生物技术和制药领域，这些聚集会严重影响蛋白的生产和应用。许多以蛋白多肽为基础研发的药物具有极大的应用前景，可是蛋白因错误折叠而导致构象发生变化形成聚集，使蛋白失活，最终影响药物疗效，造成不可估计的损失。污染物导致的蛋白聚集包括宿主细胞蛋白、非蛋白微粒和蛋白的损伤形式。

　　基于此Enzo Life Sciences 推出了新产品ProteoStat™ Protein Aggregation Assay，内含红色荧光信号染料，可特异性结合聚集蛋白，进行检测。具有最广泛的检测范围，可有效检测可见和不可见的蛋白微粒。

 ◆原理

　　蛋白聚集严重影响以蛋白为基础研发的药物。在药物制剂中，蛋白聚集在生物活性和免疫原性方面影响药效。

　　蛋白聚集发生在生产过程的各个阶段包括细胞培养、纯化、生产、储存、运输等方面。制药工业希望在生物工艺中找到新的方法，可用于检测、追踪、定量分析影响蛋白聚集的因素。

　　近年来以冻干稳定形式存在的蛋白聚集体作为标准品，可以准确地定量检测蛋白聚集，加上新颖的只需在酶标仪里即可实验的ProteoStat^® protein aggregation assay，可对蛋白检测方法进行优化。

　　在这篇文章中，使用已知浓度的聚集IgG标准品作为标准曲线，通过ProteoStat^® protein aggregation assay/standards对IgG的聚集水平进行检测，集中分析了制药工业中常见的3种聚集形式。

　　●    热诱导聚集

　　●    机械诱导聚集

　　●    冷冻和反复冻融诱导聚集

◆优点・特色

　●　高通量筛选方法用于流式细胞仪平台监测蛋白稳定性

　●　在荧光微孔板中即可进行简单、灵敏、均一地检测

　●　不需分离目的蛋白或稀释样品

　●　与传统蛋白聚集检测染料相比更灵敏，信号更明亮

　●　优化的缓冲液和辅料用于蛋白制剂研发

　●　检测灵敏度可低至亚微摩尔级别，含量在1%-5%的聚集蛋白也能被检测出

　●　在广泛的PH（4-10）和离子强度范围都可使用，提供至少两个数量级的线性动态范围

　●　使用ProteoStat^® 蛋白聚集检测标准品可对溶液中的聚集蛋白精确定量

　●　可检测蛋白多肽聚集程度，可用于筛选蛋白聚集激活剂或抑制剂

在蛋白聚集实验研究中，将ProteoStat protein aggregation assay和Synergy Mx Multi-Mode Microplate reader联用，可适合用于监测由温度、机械损伤和反复冻融所引起的蛋白聚集。

稳定的蛋白颗粒作为标准品可快速建立标准曲线，加快定量分析蛋白聚集响应。这个检测方法能够可靠地检测到浓缩抗体制剂中小于0.2%的聚集蛋白，线性动态范围为2个数量级。

ProteoStat protein aggregation assay 和ProteoStat protein aggregation standards检测蛋白聚集特点在于操作简单，能够检测低水平的蛋白聚集情况，只需30分钟，就能够得到完整的分析结果。

案例一 不同搅拌速率对蛋白聚集的影响	案例二 蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集
使用本产品检测后，可知搅拌速度越快，蛋白聚集程度越大。	蓝色曲线为对照，没有搅拌速度在300rpm下，绿色曲线与红色曲线分别表示蛋氨酸被氧化后的蛋白聚集情况与天然蛋白的聚集情况。使用本产品检测后，可知蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集。

使用流式细胞仪结合ProteoStat® 蛋白聚集分析试剂盒使用例
A ProteoStat® 蛋白聚集分析试剂盒检测IgG 聚集标准品 B ProteoStat® 蛋白聚集分析试剂盒检测硅油滴 C ProteoStat® 蛋白聚集分析试剂盒检测IgG 聚集标准品和硅油滴的混合物 使用流式细胞仪结合ProteoStat® 蛋白聚集分析试剂盒检测IgG 聚集标准品，可与其他非蛋白微粒如油滴区别开来，且无须考虑样品微粒大小（经检测>97%的IgG 聚集标准品都小于2μm）。

案例・应用

材料和方法

　　Enzo Life Sciences 推出了ProteoStat protein aggregation assay 和ProteoStat protein aggregation standards，利用荧光分子信号染料可特异性结合聚集蛋白和多肽，在微孔板中即可检测。

探针在溶液中是不发出荧光的，当与聚集蛋白的四级结构结合时会发出明亮的荧光。一旦聚集标准品发生重组，它们将含有0-12.5%的聚集蛋白，总蛋白浓度维持在1mg/mL。

通过粒子分析成像鉴定标准品发现90%的蛋白聚集体长度为2-10μm，约9%的蛋白聚集体长度为10-20μm，约0.7%的蛋白聚集体为长度大于20μm。

Synergy™ Mx Multi-Mode Microplate Reader (BioTek Instruments) 可用于所有蛋白聚集分析。它的激发波长为500nm，发射波长为600nm，激发和发射狭缝宽度为9nm，便于检测ProteoStat染料。Thioflavin T染料可以在激发单色器激发波长为435nm，发射波长为495nm，都在激发和发射狭缝宽度为9nm的条件下进行检测。

 

结果

在96孔微板中检测比较ProteoStat和Thioflavin T染料与蛋白聚集的结合能力。纯化的兔抗羊lgG(4.26mg/mL)在pH2.7的盐酸水溶液中，80℃温度下孵育90分钟后会形成蛋白聚集体。

聚集信号由聚合体和单体混合比例不同决定的，但总的lgG蛋白浓度仍然是60μg/mL。在50 mM磷酸钾，pH7，3μM ProteoStat 检测试剂或5μM Thioflavin T 染料中读数。这些浓度在以前做过预实验，已经确定是最优的浓度。

在蛋白和染料一起孵育15分钟后使用BioTek Synergy Mx Microplate Reader读数。所用的板为Greiner µClear^® black, clear bottom 96-well microplates (Greiner Bio One)。

在相同情况下，ProtesStat染料的荧光强度比Thioflavin T染料高100倍。对于浓度为1.2μg/mL的聚集体，ProteoStat染料的信噪比为12.8，而Thioflavin T染料的信噪比仅为1.2，表明ProteoStat染料在蛋白聚集检测中更准确、灵敏度更高。

正因为由此显著的优势，ProteoStat protein aggregation assay和ProteoStat protein aggregation standards通常能够共同用于各种常规形式的蛋白聚集检测。

 

监控热诱导聚集

当蛋白受到提高温度刺激会加速其聚集。羊lgG(4mg/mL)在各个时期都处于搅拌速度400rmp，100mM磷酸钠，pH7.2，温度60℃下。

在每个时间点，25μL lgG用于测量。首先样本在1x assay buffer中稀释4倍后，得到的蛋白最终浓度为1mg/mL。在每个孔中加入98uL的检测蛋白和2μL的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution，每个时间点都做平行孔。

同时，ProteoStat protein aggregation standards中含有稳定的、高质量的对照样本，用来做标准曲线。

如图1所示，使用ProteoStat染料检测羊lgG在热诱导下的聚集情况，生成的曲线表明不同阶段lgG蛋白聚集的情况。

在刚开始阶段蛋白聚集情况较少，接着观察到生长阶段聚集体开始形成，最后生长率降低直至变成0，表明蛋白单体已几乎消失，差不多完全形成聚集体。

图1：热诱导羊IgG蛋白聚集

 

监控机械诱导聚集

虽然普遍认为机械搅拌会加速蛋白聚集形成，但目前机械外力造成蛋白聚集形成的原理还不是十分明确。在药物研发中，可能受到抽真空或者过滤等产生的机械外力使蛋白药物形成聚集。

羊抗鼠lgG(10mg/mL)溶解在含有10mM的磷酸钠，150mM Nacl，0.05% 叠氮化钠，pH7.2的溶液中。机械搅拌的实验条件如下：室温、4mL的平底褐色玻璃瓶中加入200μL lgG溶液，使用Variomag^® Poly electronic stirrer (2Mag-USA)，以990rpm速度进行搅拌。搅拌棒体积为1.0×0.4×0.2cm³。

在每个时间点，取10μL lgG用于检测。样品在1×assay buffer中稀释10倍后，得到的蛋白最终浓度为1mg/mL。在每个孔中加入98uL的检测蛋白和2μL的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution，每个时间点都做平行孔。

用ProteoStat protein aggregation standards作为标准曲线，定量检测机械搅拌诱导产生的蛋白聚集。在上述实验条件下，蛋白聚集与时间成正比例关系（图2）。

图2：机械诱导样抗鼠IgG蛋白聚集

 

监控冷冻和反复冻融诱导聚集

冷冻对于蛋白稳定是至关重要的，因为在冷冻过程中会导致溶液的浓度发生变化。羊抗鼠lgG(10mg/mL) 溶解在10mM的磷酸钠，150mM Nacl，0.05% 叠氮化钠，pH7.2的溶液中。样品保存在-20℃，反复冻融数次。

在每个时间点，取10μL lgG用于检测。样品在1×assay buffer中稀释10倍后，得到的蛋白最终浓度为1mg/mL。在每个孔中加入98μL的检测蛋白和2μL的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution，每个时间点做平行孔。

用ProteoStat protein aggregation standards作标准曲线，定量检测反复冻融诱导产生的蛋白聚集体。实验表明反复冻融也会诱导产生蛋白聚集。与热诱导引起蛋白聚集一样，会观察到一条S型曲线图。