去内毒素质粒大提提取试剂盒

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去内毒素质粒大提提取试剂盒

去内毒素质粒大提提取试剂盒 
EndoFree Plasmid Maxi Kit 
产品编号： 12362  CAS号：  
分子式：   分子量：  
EINECS编号：  

纯化得到至多10 mg的无内毒素高转染级纯质粒或柯斯质粒DNA

  • 纯化得到的DNA内毒素水平低于0.1 EU/µg
  • 纯化流程快，同时去除内毒素
  • 获得高产量、高拷贝质粒DNA
  • 使用LyseBlue，获得最佳的裂解和高产量的DNA

EndoFree Plasmid Kits基于阴离子交换技术，可快速制备不含内毒素的质粒DNA。QIAfilter Cartridges过滤快速澄清裂解液。制备的DNA纯度超过两次CsCl梯度离心法所得DNA的纯度，适合超转染级纯的应用。EndoFree Plasmid Buffer Set可用于制备10次mega规模或5次giga规模转染级纯质粒或科斯质粒DNA制备。

 

Performance

EndoFree Plasmid Kit将高效的内毒素去除步骤整合到质粒纯化流程中，不需要额外步骤，也不需用亲和柱去除脂多糖。通过QIAfilter Mega-Giga Cartridge过滤细菌裂解液，并使用重力流QIAGEN-tip阴离子交换柱纯化质粒DNA。产量可达10 mg（Giga）、2.5 mg（Mega）、500 μg（Maxi）DNA。纯化的DNA无内毒素（<0.1 EU/µg DNA）。

选用EndoFree Plasmid Mega Kit而非EndoFree Plasmid Giga Kit纯化低拷贝质粒和科斯质粒，将会得到更好的效果，因为后者需要较大的培养体积，而QIAfilter Mega-Giga Cartridge的容量有限。

EndoFree Plasmid Kits去除细菌在裂解过程中释放的内毒素，内毒素会影响原代细胞和敏感培养细胞的DNA转染。从EndoFree Plasmid Kits得到的无内毒素DNA高度适用于可重复且结果可靠的转染（参见”Plasmid purification method versus transfection efficiency“和”Plasmid purity versus transfection efficiency“及表”Endotoxin levels in plasmid preparations”和”EndoFree DNA yields high transfection efficiencies with primary cells”）。QIAGEN超纯无内毒素DNA也适用于基因治疗研究和其他敏感应用。

 

质粒制备中的内毒素水平*
质粒制备方法 内毒素（EU†/µg DNA） 平均转染效率‡
EndoFree Plasmid Kit 0.1 154%
QIAGEN Plasmid Kit 9.3 100%
2x CsCl 2.6 99%
Silica-gel slurry 1230.0 24%
* 宿主菌：大肠杆菌DH5α  质粒：pRSVcat。
† 1  ng LPS = 1.8 EU。 
‡ 根据表中数据计算 。
无内毒素DNA转染原代细胞的高转染率*
DNA纯化方法 转染细胞比例
EndoFree Plasmid Kit 21.0% ± 0.93
QIAGEN Plasmid Kit 8.1% ± 0.57
Silica-gel slurry 5.2% ± 0.74
* 原代兔胃壁细胞转染pEGFP-N2（CLONTECH），pEGFP-N2由所示的方法制备。使用Effectene Transfection Reagent进行转染。该数据是细胞表达GFP的百分率，由转染48小时后绿色荧光细胞数量确定。转染效率是每种纯化方法制备的超过2个不同的DNA中6–9个复制样本的平均值。（数据由C. Chew and J. Parente提供，Department of Molecular Medicine and Genetics, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia, USA.）

Principle

纯化的质粒DNA内毒素污染水平取决于所用的纯化方法（参见”Endotoxin levels in plasmid preparations”）。硅胶技术纯化的DNA具有非常高的内毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和两次CsCl超速离心可获得相对低水平内毒素的纯DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的内毒素去除步骤，获得<0.1 EU/µg的质粒DNA。

QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊设计的过滤装置，用于代替细菌细胞碱裂解后的离心步骤。QIAfilter Cartridges可完全去除SDS沉淀，清除细菌裂解液，相比离心可大量节约时间，减少1小时的质粒纯化时间。QIAfilter Mega-Giga Cartridges采用内部真空方式轻松高效的清除大量细菌裂解液（注意：该试剂盒不包含瓶子）。

QIAGEN-tips中独特的阴离子交换树脂（不提供EndoFree Plasmid Buffer Set）专为核酸纯化而开发。它卓越的分离性能使得DNA纯度与连续两次CsCl梯度离心获得的DNA纯度相当。由重力流驱动并持续运转的预装QIAGEN-tips，最大限度减少手动制备质粒所需的时间。整个QIAGEN质粒纯化系统不使用有毒物质，如苯酚，氯仿，溴化乙锭和CsCl，最大限度地减少对用户和环境的危害。

内毒素，又称脂多糖或LPS，是大肠杆菌等革兰氏阴性菌细胞膜的组成部分，如大肠杆菌（参见”Bacterial cell wall“）。内毒素在质粒裂解纯化过程中释放出来，并显著降低内毒素敏感细胞株的转染效率。此外，内毒素与DNA竞争“自由”转染试剂，影响转染实验中质粒DNA的摄取。内毒素也诱导巨噬细胞和B细胞等免疫细胞发生非特异性免疫反应，从而导致转染结果的误读。这些反应包括诱导的蛋白质和脂类，如IL-1和前列腺素等的合成。总体而言，内毒素在转染实验中是不可控变量，影响结果的可重复性，使它们难以对比、解读。在基因治疗研究中，内毒素可造成内毒素休克综合症和激活补体级联，干扰研究。

Procedure

在碱性条件下，细菌细胞裂解，使用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。将Endotoxin Removal Buffer加入到过滤后的裂解液中。冰浴后，将纯净的裂解物上样到阴离子交换柱上，在适当的低盐和pH条件下，质粒DNA选择性结合。用中盐缓冲液清除RNA、蛋白质、代谢产物和其他低分子量杂质，超纯质粒DNA被高盐缓冲液洗脱（参见”QIAGEN Plasmid Kit procedures“）。最后DNA由异丙醇脱盐、沉淀并且离心回收。

Applications

使用EndoFree Plasmid Kits纯化的DNA适合多种敏感应用，包括：

  • 转染，包括原代、敏感以及悬浮细胞
  • 基因治疗研究
  • 基因沉默
  • 显微注射