新型亲和法外泌体提取试剂盒

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS

 

　　MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS采用磷酯酰丝氨酸（PS）亲和Tim4蛋白固化磁珠（PS亲和法）的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高纯度的外泌体，请使用10,000×g离心后的上清。

　　该试剂盒使用含有EDTA的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来，所提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验，包括电镜分析（TEM）、纳米粒子追踪（NTA）分析、投喂实验、分子组成（蛋白质、脂质、核酸等）分析等。

 

◆膜表面磷酯酰丝氨酸（PS）亲和法

　　Tim4蛋白固化磁珠，在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸（PS），然后使用含有EDTA的洗脱液进行洗脱，捕获高纯度的完整细胞外囊泡

◆优点・特色

 

 

使用新型亲和提取方法

●　通过PS亲和分子回收 ●　低背景值 ●　在中性条件下通过螯合试剂进行温和洗脱 ※　可获得高纯度，完整的外泌体

无需进行超离

●　使用磁珠改进了操作

●　流程优化

※　高重复性

与其他提取方法相比
方法	外囊泡纯度	囊泡状态	可操作性	回收量
PS亲和法	■■■	完整	简便稳定	■■■
超速离心法	■■	完整	简便	■■
聚合物沉淀法	■	完整	简便快捷	■■■■
密度梯度离心法	■■■■	完整	复杂	■■
抗体亲和法	■■■	不完整	简便稳定	■■

样品类型：细胞培养上清、血清、血浆、尿液等。

●　可以纯化高纯度和完整的细胞外囊泡

●　可以从细胞上清液、血清、血浆和尿液中纯化外囊泡

●　重复性高，回收量稳定

●　简易操作（约3.5小时）

●　启用多个样品（无需超速离心）

◆产品列表

产品名称	包装规格		保存条件
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS	10次 （产品编号：293-77601）	2次 （产品编号：299-77603）	2-10°C
试剂盒成分 (1) 链霉亲和素磁珠 (2)生物素标记的外泌体捕获 (3)外泌体捕获免疫固定缓冲液 (4)外泌体结合增强剂(×500) (5)洗涤缓冲液 (6)外泌体洗脱缓冲液 (7)反应管	<10 次>  600 μL×1 管  100 μL×1 管  35 mL×1 瓶  500 μL×1 管  75 mL×2 瓶  5 mL×1 瓶  22 管	<2 次>  120 μL×1 管  20 μL×1 管  7 mL×1 瓶  100 μL×1 管  30 mL×2 瓶  1 mL×1 瓶  1 管

 *每套试剂盒能完成5次回收实验，即实际使用量为10×5次/Kit与2×5次/Kit

◆案例•应用

从血清、血浆、尿液中提取的细胞外囊泡的分析

从人血清中提取外泌体的产量比较

　　使用该试剂盒，超离法和抗体亲和法提取人血清的外泌体，接着用CD9和CD63抗体进行免疫印迹实验。

●　检测抗体

      抗CD9兔多抗，System Bioscience公司

      抗CD63兔多抗，System Bioscience公司

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果相当于150μL的血清样本。从100μL提取物中取出15μL，添加5μL的4×SDS样品缓冲液，全部上样。

 

从人EDTA血浆中提取外泌体

　　分别从1mL的EDTA血浆、EDTA血浆（超滤更换缓冲液）、人血清中提取外泌体，进行WB检测（抗Flotillin2抗体）。

●　检测抗体

      抗Flotillin-2小鼠单抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience公司

●　使用样品量

      各1mL

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果分别对应150μL样品量。从100μL提取物中取出15μL，添加5μL的 4×SDS样品缓冲液，全部上样。

 

从人尿液中提取外泌体的回收量比较

　　1mL人尿液分别通过本试剂盒、聚合物沉淀法、超离法进行外泌体回收，并做免疫印迹（WB）检测（抗CD9抗体）。

●　检测抗体

      抗CD9兔多抗，System Biosciences公司

●　使用样品量

      各1mL

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果分别对应150μL尿液样品。从100μL提取物中取出15μL，加入5μL的 4×SDS样品缓冲液，全部上样。

 

◆与传统沉淀法的功能比较实验

　　分别用本试剂盒、超离心法和聚合物沉淀法从K562（人慢性骨髓性白血病）细胞培养上清（无血清培养上清或10%Exosome-depleted FBS添加培养基）提取外泌体，分别比较三种方法的外泌体回收量和外泌体纯度。

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS【PS亲和法】

　　按照试剂盒的操作说明（反应时间：3小时），从1mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）中提取外泌体。

超速离心法

　　将10mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）进行超离（110,000×g，70min），用TBS缓冲液重悬沉淀物后，再进行超离（110,000×g，70min），回收沉淀部分。

聚合物沉淀法

　　从1mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）中，按照市售的A公司产品的操作说明（静置时间：过夜）提取外泌体。

※1：110,000×g离心2小时，在不吸到沉淀的前提下回收上清。

 

比较提取的外泌体的透射电子显微镜（TEM）分析结果和纳米粒子追踪（NTA）分析结果

　　分别用本试剂盒、超离法、聚合物沉淀法提取外泌体，用NanoSight LM10检测外泌体片段的粒子直径。另外，用最终浓度为2%的多聚甲醛固定提取到的外泌体片段（2~4×10¹⁰ particles），在透射电子显微镜进行分析。

电子显微镜图像 数据提供：金泽大学 医学系 华山教授、大阪大学 iFReC 中井先生

MagCapture™可提取到很多100nm左右的粒子，在透射电子显微镜中也可以确认到很多细胞外囊泡。

 

K562细胞培养上清提取的外泌体回收量和纯度的比较（无血清培养基）

　　用PS亲和法、超离法和聚合物沉淀法从K562 细胞培养上清（无血清培养基）获得样品进行电泳。接着用银染色和WB法（CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗体）进行实验。

回收量，不是回收率

●　检测抗体

     抗CD63小鼠单抗（MEM-259）

     抗Flotillin-2 小鼠单抗  （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠单抗 （25/Lamp-1），BD Bioscience公司

 

K562细胞培养上清提取外泌体的回收量和纯度的比较（10%FBS-添加培养基）

　　用MagCapture™外泌体提取试剂盒 、超离法和聚合物沉淀法，从K562 细胞培养上清（10% 去外泌体 FBS补充培养基）获得样品进行电泳，用银染法和WB法（CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗体）进行实验。同时，对外泌体提取片段进行质谱测定，比较所有测定的多肽中来自K562细胞的人来源多肽的比例（由于添加到细胞培养基的FBS中牛蛋白聚集体是混杂的，所以人来源多肽的比率会下降）。

●　检测抗体

     抗CD63小鼠单抗（MEM-259）

     抗Flotillin-2小鼠单抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠单抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司

     健康人血清来源的外泌体中提取miRNA和mRNA的回收量比较

实验数据

①运用不同方法提取外泌体并比较从中提取的microRNA和mRNA的回收量

通过超离法和PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

相比超离法，PS亲和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高产量。

②运用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比较

　　运用PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）或基于AGPC法的试剂提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

对比AGPC法，使用microRNA提取试剂盒更能有效提取PS亲和法纯化所得EVs中的microRNA和mRNA

◆外泌体蛋白质组学分析

<实验内容及结果>

　　分别利用PS亲和法、超离法、聚合物沉淀法，从含10% FBS（不含外泌体）的K562细胞培养上清液中提取外泌体。将提取样品用10%聚丙烯酰胺电泳分离，剪切出全部的蛋白质条带。然后在凝胶内进行消化，用LC-MS对蛋白质进行检测。对上述三种方法提取的外泌体进行蛋白质组合的相关性比较。

比较通过MASS分析鉴定的前10个蛋白质

白色柱：源自外囊泡的人类蛋白质

灰色柱：来自FBS的牛蛋白污染物

红 色：来自外囊泡的标记蛋白

样品：K562细胞培养基（含有10%去除外泌体胎牛血清）

	PS亲和法	超离法	聚合物沉淀法
1	71kDa热休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein)	DNA依赖蛋白激酶催化亚基基因 (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)	补体C3 (Complement C3)
2	膜联蛋白A6 (Annexin A6)	铁转蛋白受体1 (Transferrin receptor protein1)	α2-巨球蛋 (Alpha-2-macroglobulin)
3	铁转蛋白受体1 (Transferrin receptor protein1)	血清白蛋白 (Serum albumin)	纤连蛋白 (Fibronectin)
4	V-ATP酶A亚基 (V-type proton ATpase catalytic subunit A)	ATP依赖RNA解旋酶 (ATP-dependent RNA helicase A)	血清白蛋白 (Serum albumin)
5	浮舰蛋白-2 (Flotillin-2)	微管蛋白β5 (Tubulin beta-5 chain)	血小板反应蛋白-1 (Thrombospondin-1)
6	程序性细胞死亡6互作蛋白(Programmed cell death 6-interacting protein)	71kDa热休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein)	补体C4 (Complement C4)
7	细胞表面抗原4F2重链 (4F2 cell-surface antigen heavy chain )	脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase)	α-1抗蛋白酶 (Alpha-1-antiproteinase)
8	膜联蛋白A1 (Annexin A1)	细胞表面抗原4F2重链 (4F2 cell-surface antigen heavy chain)	载脂蛋白-β-100 (Apolipoprotein-β-100)
9	220kDa激酶D相互作用底物 (Kinase D-interacting substrate of 220kDa)	U5小核核糖核蛋白的解旋酶 (U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase)	胎儿血红蛋白亚单位 (Hemoglobin fetal subunit beta)
10	膜联蛋白A2 (Annexin A2)	β4微管蛋白 (Tubulin beta-4B chain)	β5微管蛋白 (Tubulin beta-5 chain)

成对组合相关性比较

 

◆应用数据

Protein Assay BCA Kit检测外泌体的蛋白质浓度

　　Protein Assay BCA Kit是利用二辛可宁酸（BCA）定量检测溶液中的蛋白质浓度的试剂盒，是蛋白质定量检测法中最通用的方法。其原理为，碱性条件下的蛋白质Cu²⁺离子被还原为Cu⁺。Cu⁺与BCA形成络合物，即产生紫色螯合物，蛋白质浓度与紫色螯合物颜色深浅有关，通过测定562nm处的吸光度，并与标准曲线做比照，即可定量溶液中的蛋白质浓度。

利用MagCapture™外泌体提取试剂盒从细胞培养上清液中提取外泌体，通过Protein Assay BCA Kit高灵敏的检测外泌体中蛋白质浓度。

【实验内容及结果】

　　将通过MagCapture™外泌体提取试剂盒提取的25μL外泌体溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit中试剂A和试剂B混合液200μL。之后60℃孵育30分钟，检测560nm吸光度（图1）。结果表明，通过Protein Assay BCA Kit的高灵敏度检测，可测定提取后外泌体中蛋白质浓度。

图1. Protein Assay BCA Kit 检测BSA的检量线和提取的外泌体蛋白质浓度的检测

 

<BCA Assay 操作概要>

由于外泌体蛋白质浓度相当低，因此BCA测定时不要稀释样品。

①    将BSA标准溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625μg／mL和空白对照，分别每孔25μL加到96孔板中。

②    分别把提取的外泌体和洗脱缓冲液（空白）按照每孔25μL加入96孔板。

③    把200μL Protein Assay BCA Kit（产品编号：297-73101）的试剂A盒试剂B混合液（A:B=50:1）加入放有样品的孔板中。

④    60℃孵育30分钟

⑤    室温条件下降低孔板温度

⑥    测定560nm的吸光度

 

产品编号	产品名称	包装
297-73101	Protein Assay BCA Kit 蛋白测定试剂盒（二喹啉甲酸）	250次用
015-25613	2 mg/mL Albumin Solution   from Bovine Serum 2mg/mL 牛血清蛋白溶液	1mL×10

 

◆外泌体的标记和Hela细胞导入实验

【实验概要】

用PKH67（Sigma公司）标记MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的细胞外囊泡， Hela细胞导入确认

<外泌体PKH67标记>

1. MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取外泌体（实验当天从K562细胞培养上清液提取外泌体）

2. 用BCA Assay和NanoSight检测样品的蛋白质浓度和粒子浓度

3. 将相当于5μg*蛋白量的外泌体样品溶液分装至1.5mL管中。

*请配制合适的使用量

4. 将2.0μL的PKH linker溶解在0.25mL的DiluentC中。…4×Dye solution*

*请配制合适的使用量

5. 添加1/3样品量的4×Dye solution至样品中，混合后在室温中孵育5-10分钟。

6. 根据附带的操作说明用PBS平衡Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo公司）。

7. 将100μL样品分别加入上述平衡后的旋转柱*中，离心（最大添加量：100μL）。

*准备必需的支数。

8. 将外泌体溶液*加入到已经接种好Hela细胞的培养皿中，24小时后用显微镜观察并利用流式细胞仪进行分析。

*根据实验调节外泌体添加量

图1. PKH标记外泌体的细胞捕获观察

从16mL K562培养上清液中超滤浓缩得到4mL培养上清液作为样品，通过PS亲和法提取外泌体。

●      提取的外泌体蛋白质浓度：22.3ng/μL

●      粒子浓度：1.2×10⁸ particles/mL

将上述标记的外泌体溶液全部加入接种好的Hela细胞中，24小时后用荧光显微镜（左）和流式细胞仪（右）检测捕获情况。

Opti-MEM：取相同量用PKH标记后添加到细胞中作为阴性对照。

 

◆细胞培养上清•血清•血浆的预处理操作

　　样品预处理：对样品进行1,200×g离心操作※1。如果要得到更高纯度的外泌体，则按照下述步骤对样品进行10,000×g离心操作※2。

　　下文是细胞培养上清、血清/血浆的预处理方法。其他体液样品的预处理操作，请参考血清/血浆的实验步骤，做适当调整。

更换缓冲液（限制过滤）操作

用50 mL TBS 缓冲液对1 mL 已经经过离心处理的EDTA 血浆样品进行缓冲液更换。

1. 把19 mL TBS 加进VivaSpin20（100K）中。

2. 把1 mL 离心过的EDTA 血浆上清添加在第1. 的VivaSpin20（100K）中，

　混匀。

3. 把第2. 的VivaSpin20（100K）在4℃下进行离心处理。

4. 减少上线的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 缓冲液。

5. 4℃下离心处理。

6. 减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 缓冲液。

7. 4℃下离心处理。

8. 减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加11 mL TBS 缓冲液。

9. 4℃下离心处理直至样品液量达到1 mL 以下。

10. 进行提取。

 

◆MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 操作步骤

 

更多应用说明，请点击：

新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用

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PS亲合法

　　通过使用T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白域包含蛋白4（Tim4）分离高度纯化的外泌体。Tim4是在巨噬细胞上表达的I型跨膜蛋白，其强烈结合磷酯酰丝氨酸，不仅显示在凋亡细胞上，而且显示在外泌体和微泡。使用Tim4蛋白，其特异性结合显示在外泌体表面上的磷酯酰丝氨酸。因为结合是Ca²⁺依赖性的，完整的外泌体可以通过添加Ca²⁺螯合剂容易地从Tim 4释放。值得注意的是，利用PS亲和法提取的外泌体纯度之高可以用过质谱显示的。还用于从细胞条件培养基沉淀中分离大外泌体和通过ELISA、流式细胞术对外泌体的灵敏定量。这些结果表明通过Tim4蛋白纯化的有用性表征Evs的真正功能。

（Wataru Nakai, Takeshi Yoshida, Diego Diez etl.A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles[J]Nature, Scientific Reports 6, Article number: 33935 (2016). doi:10.1038/srep33935）

和光外泌体提取试剂盒宣传页	Wako外泌体英文版说明书.pdf
成功研发提取高纯度外泌体方法	MagCapture™ 外泌体提取试剂盒中文说明书
Exosome外泌体提取试剂盒.pdf

操作流程

样品制备流程（步骤1）

外泌体捕获固定流程（步骤2）

亲和提取流程（步骤3—5）

外泌体提取血浆样品前处理步骤

使用TBS缓冲液进行缓冲液交换

1、向VIVASPIN 20（100K）中添加19mL TBS缓冲液。

2、将1ml血浆添加到（步骤1）的VIVASPIN 20（100K）中并混合。

3、离心（步骤2）中的VIVASPIN 20（100K）。 （离心条件参考使用说明书）

4、当上层液体下降时，添加10mL TBS缓冲液到（步骤3）的VIVASPIN 20（100K）中。

5、离心。

6、当上层液体下降时，添加10mL TBS缓冲液到（步骤5）的VIVASPIN 20（100K）中。

7、离心。

8、当上层液体下降时，添加11mL TBS缓冲液到（步骤7）的VIVASPIN 20（100K）中。

9、离心VIVASPIN 20（100K），直到样品体积变为1mL。

该方案共计使用50mL的TBS缓冲液。

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒

常见问题

•　关于试剂盒的规范、性能

Q1　本试剂盒使用了抗体吗？

Ａ1　没有使用抗体。使用了与金属离子结合和与磷酯酰丝氨酸（PS）结合的蛋白。

 

Q2　用此款试剂盒可提取什么样的细胞外囊泡呢？

Ａ2　外泌体和大型细胞外囊泡（微小泡）。

Q3　外泌体和微泡的区别是？

Ａ3　外泌体，是来源于晚期胞内体，直径为40-100nm的细胞外囊泡。微泡来源于细胞膜，直径100-1000nm的细

　     胞外囊泡。

 

Q4　外泌体和微泡能可以分别纯化吗？

Ａ4　可以。同时纯化的情况下，1200×g离心取上清液。纯化外泌体的情况下，10000×g离心取上清液。只纯化微

         泡的情况下，10000×g离心，沉淀置于TBS制成悬浊液备用。样品的前处理请参考操作说明书。

 

Q5　外壳型病毒也能回收吗？

A5　能。外壳性病毒膜表面也有PS，混入外壳性病毒的样品，所有PS都能回收。需要分离的情况下，使用本试剂盒

        回收后，需要用与病毒或者外泌体特异性抗原的抗体纯化。

 

Q6　所有的外泌体都会暴露磷脂酰丝氨酸（PS）吗？

A6　尚未得到实验验证。通过分析外泌体的膜脂成分证实，有几种细胞（小鼠少突胶质细胞）来源于外泌体。因

        此，不会暴露PS。另一方面有可能存在少量PS暴露的外泌体，而此款试剂不能纯化这种外泌体。但是，使用

        该试剂纯化到的外泌体，已确认有多个外泌体标记蛋白，与以单一类型的表面标记蛋白作为抗原的传统亲和方

        法相比，以膜脂成分为抗原的该试剂能取得更多种类的外泌体。另外，虽然识别表面标记蛋白的抗体可能无法

        识别不同动物来源的抗原，但是该试剂能解决这一问题（人类、小鼠、牛等都能应用）。而且已验证了可以纯

        化超速离心时需沉淀才能回收的外泌体。

 

Q7　该试剂盒的样品是什么？

A7　使用细胞培养上层清液、血清或尿液效果显著。如果血浆中添加了螯合剂（比如EDTA）和柠檬酸，原理上无

        法分离外泌体。若要回收，可通过超滤更换缓冲液来回收。具体步骤请看相关资料。由于肝素处理过的血浆回

        收率低，从血液样本中回收请使用血清。另外有客户成功从血浆、脑脊髓液中回收外泌体。

 

Q8　一次能回收多少外泌体？

A8　根据样品的种类和数量有很大的差异，据研究所实验记录，在一次的分离中最多能回收30μg蛋白质（通过

        BCA法检测）、1-2×10¹⁰粒子（通过纳米技术检测）。（K562培养基中的莫能菌素能促进外泌体分泌，可取

        5mL培养上清液进行回收）。

        1 mL正常人混合血清能回收5×10⁹颗粒（通过纳米技术检测）。

 

•　与传统法的比较

Q9　与超速离心法相比好处在哪？

A9　与超速离心法相比，本试剂盒能更简便、重复性好、高效地回收高纯度外泌体。也能回收超速离心法无法沉淀

        的外泌体。

 

Q10　与传统抗体亲和法相比，PS亲和的优势是什么？

A10　采用传统的抗体亲和法是用变性剂进行洗脱，此款试剂盒是在中性环境下用螯合剂来洗脱的，能完整回收外

          泌体，不会混入非特异性吸附物，能获得高纯度外泌体，提取纯度更高。传统的抗体亲和法只能特异性识别

          一种外泌体表面Marker蛋白质，而本试剂盒是特异性识别膜脂质成分，更能广泛获得外泌体。有事例表明识

          别表面Marker蛋白质抗体不能识别不同动物物种的抗原，而本试剂盒能在大范围的动物物种中运用（人，

          小鼠，牛等都有报道）。

 

Q11　与其他方法相比回收的纯度如何？

A11　与传统沉淀法（超速离心法、多聚物沉淀法）相比，纯度更高。与超速离心法和密度梯度离心法相结合的方

          法相比，能简便地获得同等高纯度的外泌体。（原因：采用抗体的传统亲和法是用变性剂进行洗脱，因此很

          容易混入粒子等非特异性吸附物。然而此款试剂盒是用螯合剂来洗脱的，所以难以混入非特异性吸附物。）

 

Q12　与其他方法相比回收率如何？

A12　与采用抗体的传统亲和法、超速离心法相比，能获得更高的回收率（低于聚合物沉淀法）。

 

•　关于试剂盒的操作方法、组成

Q13　操作该试剂盒耗时多久？

A13　（1个小时预处理样品），该试剂盒Exosome Capture磁珠的固定需要15分钟，然后3个小时的化学反应，

           最后15分钟洗脱，总计3小时30分钟。

 

Q14　本试剂盒需要特别慎重的操作吗？

A14　Exosome Capture固定化磁珠与样品反应后的清洗步骤中最后需要去除洗净液。完全去除后再进行提取。

          提取时在提取液中加入磁珠后，确保磁珠不发生凝集并处于悬浮状态。

 

Q15　提取液的组成有哪些？

A15　是含有1mM的螯合剂、盐、防腐剂的Tris基础溶液。若以上成分阻碍后续分析，请使用超速离心膜

         （Sartorius公司  VivaSpin500，使用100K分子量截留，Code：VS0141）并替换合适的Buffer。

 

Q16　Exosome Capture 固定后磁珠可以循环利用吗？

A16　可以。为了能够高效回收样品中的外泌体，试剂盒可完成5次回收实验。试剂盒里的缓冲液只含5次纯化的

          量。1mL体积以上样本建议进行浓缩后再回收，纯化时可进行反复抽提，提高纯化效率。详情参考操作说

          明书。

 

Q17　Exosome Capture固定化磁珠能保存吗？

A17　可以。洗脱出外泌体后的磁珠需再使用，用试剂盒附带的 Washing buffer或自制的TBS冷藏保存。

 

Q18　实验要留到第二天需要做什么步骤？

A18　Exosome Capture固定化磁珠与样品的反应步骤（反应时间3小时）可以过夜（置于4℃下）。

 

•　关于样品用量

Q19　样品纯化所需的最低量是？

A19　使用旋转器的需要500μL以上，使用离心管混合器的需要100μL。样品量更少的情况下加TBS到所需最低量后

          再使用Exosome Capture固定化磁珠。

 

Q20　大量的样品能回收吗？

A20　可浓缩后再回收。如果样品是培养上清，可以从体积50毫升的样品中回收外泌体。离心分离预处理后，取

          50mL上清液超离浓缩至1mL（推荐Sartorius Viva Spin20 使用100K分子量截留、Code：VS2041）。无

          血清培养基和添加了10% FBS的培养基也可以收集外泌体。详情参照操作说明书。因为血清样品无法浓缩，

          最多只能用10ｍL的样品。但是大于1mL的血清回收率低，建议反复提纯。

 

•　关于外泌体提取后的分析

Q21　外泌体中含有什么？

A21　含有蛋白质、脂质、核酸（DNA、microRNA、mRNA）等。

 

Q22　提取后的细胞外囊泡可以用什么方法检测？

A22　因为能得到完整的细胞外囊泡，可以使用所有的分析方法。

         （例）蛋白质分析：蛋白质电泳、免疫印迹、质谱分析、流式细胞术、ELISA等

      核酸分析如：定量PCR、微阵列（生物芯片）、新一代测序等

      粒子分析：电镜分析，纳米位点分析（NTA）等

      功能分析：体内外的用药实验等

 

Q23　提取后的细胞外囊泡（EVs）能直接添加到细胞使用中吗？

A23　可以使用，但有需要注意的地方。如果提取液的成分有影响，参考Q15替换合适的Buffer。使用离心过滤

          部件。

         （Millipore公司ΜLtrafree – MC， GV 0.22μm 已灭菌、Code：UFC30GV0S）除菌。

 

Q24　电镜分析需要外泌体的量是多少？

A24　能用电镜观察到2-4×10¹⁰的粒子（通过纳米技术检测）。

 

Q25　提取出的细胞外囊泡的保存条件是？

A25　冷藏、冷冻保存。长期保存需要放到-80℃。

          为避免冻结溶解，冻结保存推荐细分后保存。

 

Q26　如何做回收的外泌体提取液的免疫印迹？

A26　本公司研究所从回收的100 μL提取液抽取15 μL，加入5 μL 4×SDS样品Buffer，共20μL的样品全量上样进行

          SDS-PAGE。用量与宣传册上的免疫印迹的样本量一致。

Q27　Exosome质谱检测的步骤是？

A27　外泌体提取→SDS-PAGE与胶内酶切→通过LC-MC/MS进行蛋白质组学分析

 

•　关于外泌体标记

Q28　用该试剂盒提取出来的囊泡怎么判断是外泌体呢？

A28　根据表面抗原的抗体（WB）、电子显微镜、密度梯度离心、纳米粒度测量（如NanoSight LM10）等来

          验证。

Q29　外泌体分离后用免疫印迹法确认的标记蛋白是什么？

A29　CD9， CD63， CD81， Frotillin-2， Lamp-1等。

 

•　相关产品

Q30　有在销售和光检测外泌体用的抗体吗？

A30　本公司当前销售以下抗体。

          Anti CD9 for Exosome Isolation（Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M01-50UL）

          Anti CD81 for Exosome Isolation（Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M03-50UL）

          Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)（Wako Cat. NO.012-27063）

          Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)（Wako Cat. NO.016-27061）

 

Q31　有可以从分离囊泡里提纯RNA的试剂盒吗？

A31　有。可使用microRNA Extractor SP Kit（295-71701）比AGPC法更能高效提纯RNA。

 

Q32　有销售磁支架吗？

A32　有的。Wako品牌，产品编号290-35591，MagCapture系列磁珠捕获用磁力架。”

 

Q33　该技术专利是什么？

A33　已申请PCT专利。

Q34　加入什么金属离子？

A34　钙离子

 

Q35　血浆提取方法是？

A35　请查看相关资料。

Q36　试剂盒中的22支反应管有什么特殊之处吗？用普通的1.5mL离心管可以吗？

A36　该试剂盒中的反应管使用特殊材质，可减少磁珠吸附，该反应管可单卖

A36　BMBio BM-15 Ring Lock Tube 1.7mL 500 tubes/box 1。

[1]	W. Nakai, et al, Sci Rep 6, 33935 (2016).  A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles. PMID: 27659060
[2]	A. Kraft, W81 Award. Regulating Cancer-Associated Fibroblast Biology in Prostate Cancer (2017).
[3]	S. Osawa et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 232-238 (2017). Fibronectin on extracellular  vesicles from microvascular endothelial cells is involved in the vesicle uptake into  oligodendrocyte precursor cells. PMID: 28499870
[4]	S. Nagashima et al,  , J. Virol., 91(22) e00822-17 (2017). Characterization of the Quasi-Enveloped Hepatitis E Virus Particles Released by the Cellular Exosomal Pathway. PMID: 28878075
[5]	T. Yoshida et al, Curr. Protoc. Cell Biol., 11;777:3.45.1-3.45.18 (2017). High Purity Isolation and  Sensitive Quantification of Extracellular Vesicles Using Affinity to TIM4. PMID: 29227551
[6]	S. Saito et al,  Sci Rep 8, 3997 (2018).   Glycome analysis of extracellular vesicles derived from human induced pluripotent stem cells using lectin microarray. PMID: 29507392
[7]	H. Kobayashi et al, Nagoya J Med Sci., 80(2), 141-153 (2018).  Effects of exosomes derived from the induced pluripotent stem cells on skin wound healing. PMID: 29915432
[8]	Y. Obata, et al., JCI Insight 3(8), 99680,  (2018) Adiponectin/T-cadherin system enhances exosome biogenesis and decreases cellular ceramides by exosomal release. PMID: 29669945
[9]	RC. Middleton, et al., J Extracell Vesicles 7(1) 1456888 (2018).  Newt cells secrete extracellular vesicles with therapeutic bioactivity in mammalian cardiomyocytes. PMID: 29696078
[10]	H. Kawahara, et al., Biol. Pharm. Bull. 41, 1119–1125 (2018). The Role of Exosomes/Extracellular Vesicles in Neural Signal Transduction. PMID: 30068858
[11]	M. Santiana, et al., Cell Host & Microbe 24, 208–220 (2018). Vesicle-Cloaked Virus Clusters Are Optimal Units for Inter-organismal Viral Transmission. PMID: 30092198