人类骨髓、脂肪、脐带等组织来源的间充质干细胞 原代分离、扩增与传代培养

一、实验准备 
1、人间充质干细胞培养基配制 
（1）37℃快速解冻人间充质干细胞添加剂，快速溶解时不易破坏添加剂中营养物质，时间大致为 10min。待添加剂融化后摇匀，分装或直接按比例添加到基础培养基中，分装后添加剂立即储存于-20℃至-80℃，避免反复冻融 。 
（2）将添加剂以 10%比例加入到人间充质干细胞基础培养基中，混匀，即为人间充质干细胞培养基 （JP9401）。混合后培养基可在 2-8℃ 稳定储存 2-3 周，不建议使用已配制超过 3 周的培养基。 
（3）人间充质干细胞培养基可直接应用于人类骨髓、脂肪、脐带等组织来源的间充质干细胞的原代分离、扩增与传代培养。 
二、操作方法(以下步骤皆应在无菌条件下操作) 
1、hMSC 细胞复苏(10cm dish) 
（1）从液氮中取出冻存的 hMSC 细胞，迅速将冻存管放入 37℃水浴快速融解。 
（2）在生物安全柜或超净台中，将解冻后的细胞悬液缓慢加入 5 mL 预温的人间充质干细胞培养基（JP9401)。 
（3）1200rpm 离心 3 min，吸掉上清，加入 10ml 人间充质干细胞培养基重悬细胞。 
（4）将细胞均匀铺到培养皿中，水平十字振动培养皿使细胞均匀分布，5% CO₂的 37℃恒温细胞培养箱中培养 24 小时后观察细胞状态。
（5）24h 后更换新鲜人间充质干细胞培养基继续培养，每 2-3 天更换培养液。 
2、hMSC 细胞传代培养 
（1）在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到 90%，即可传代。 
（2）在超净台/安全柜中，吸掉原有培养基，加入 PBS 溶液清洗一次，加入细胞消化液（JP9411）使之完全覆盖皿/瓶底。 
（3）室温孵育 4-5 分钟或 37℃孵育 2-4 分钟，显微镜下观察大部分细胞脱离皿底即停止消化。 
（4）加入消化液 2 倍体积的人间充质干细胞培养基，用移液器轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。 
（5）将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中，1200 rpm 离心 3 min。 
（6）弃上清，加入人间充质干细胞培养基，重悬细胞，计数。1：3-1：4 比例传代，或按 1-2×10⁴ cells/cm2 传代，均匀铺在培养皿/瓶中，置于 37℃，5%CO₂ 培养箱中培养。 
注意：细胞传代所需的时间：2-4 天。5 代及之前的细胞，生长速度较快。5 代以后的细胞，生长速度稍缓。 
3、hMSC 细胞冻存 
（1）细胞达到 90%汇合度， 吸掉原有培养基，PBS 清洗一次。 
（2）加入细胞消化液（JP9411）使之完全覆盖皿/瓶底，室温孵育 4-5min 或 37℃孵育 2-4min 分钟，显微镜下观察大部分细胞脱离皿底即停止消化。 
（3）加入消化液 2 倍体积的人间充质干细胞培养基，用移液枪轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。 
（4）将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中，1200 rpm 离心 3 min，吸掉上清。 
（5）加入适量无血清细胞冻存液（JP9417），调整细胞冻存密度在 1×10⁶ cells/mL 左右，每支冻存管分装 1.5-2ml。 
（6）直接放入-80℃，24h 后转入液氮中长期保存。

基础培养基2-8℃，添加剂-20℃至-80℃；混合后2-8℃。保质期：12月

无色液体

7.0-7.4