MVCD1, VAS, vascular endothelial growth factor A, Vascular permeability factor, Vasculotropin, VEGF, VEGFA, VEGF-A, VEGFMGC70609, VPF, VPFvascular endothelial growth factor,小鼠血管内皮生长因子Elisa试剂盒

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗小鼠VEGF抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的VEGF与固相抗体和检测抗体结合，形成免疫复合物。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）。洗涤后，加入显色底物，避光显色。加入终止液终止反应，在450nm波长（参考校正波长540nm或570nm）测定吸光度值。

请在试剂盒有效期内使用（新老产品随机发货）

组成	规格	拆封后，稀释或重溶的试剂有效期
Mouse VEGF Microplate	1块	将未使用的板条放回带有干燥剂的铝箔袋中密封后，可在2-8℃储存30天
Mouse VEGF标准品	2支	溶解后，计算用量分装，可在-20°C储存14天
Mouse VEGF检测抗体	1支	浓缩体积溶解后，可在2-8°C储存14天
40×SA-HRP	1支	40×浓度可在2-8°C储存；1×工作浓度不建议保存
10×浓缩稀释用缓冲液	1瓶	开封后，可在2-8°C储存30天
显色液	1瓶
终止液	1瓶
20×浓缩洗涤缓冲液	1瓶
封板膜	3张	常温储存，为避免污染，不可重复使用

15.6pg/mL-1000pg/mL

需自备试验器材
1. 酶标仪（可测量450nm检测波长的吸收值及540nm或570nm校正波长的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸头
3. 蒸馏水或去离子水
4. 洗瓶（喷瓶）、多通道洗板器或自动洗板机
5. 500mL量筒

一、实验前准备
1. 样品搜集及储存
①细胞培养上清：颗粒物应通过离心去除；立刻检测样本。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
②血清：使用血清分离管（SST）收集样本，样品室温放置30分钟。离心15分钟，转速为1000g。立即取出血清，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
③血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸作为抗凝血剂收集血浆，在收集后30分钟内离心15分钟，转速为1000g，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
2. 试剂配制（使用前请将所有试剂和样本放置于室温，静置 15 分钟。建议所有的实验样本和标准品做复孔检测）
①1×洗涤液配制：试剂盒中的浓缩洗涤液为20×母液，使用前需使用蒸馏水稀释为1×工作液。例：取10mL浓缩洗涤液+190mL蒸馏水定容至200mL，实际操作时可先计算使用量，再进行配制。
②1×稀释用缓冲液配制：试剂盒中的浓缩稀释用缓冲液为10×母液，使用前需使用蒸馏水稀释至1×工作液。例：取3mL浓缩稀释用缓冲液+27mL蒸馏水定容至30mL。实际操作时可先依据样本稀释倍数，计算所需的稀释用缓冲液用量，再进行配制。
③检测抗体：将干粉离心至管底，使用110uL稀释用缓冲液（1×）溶解，室温静置5分钟后得到100×母液；使用前需稀释为1×工作液。按照每孔用量100uL计算所需体积。例：使用了10个孔，则取10uL的100倍工作浓度的检测抗体，使用稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
④SA-HRP：SA-HRP为40×母液，使用前需使用稀释缓冲液（1×）稀释配制成1×工作液，每孔所需量为100uL。例：使用了10个孔，则取25uL的40×母液+975uL稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
⑤显色剂：按每孔100uL，计算当次试验所需要用量，取出相应体积的显色剂，避光；取出的显色剂仅供当日使用。
⑥标准品：冻干标准品用稀释用缓冲液（1×）重溶，重溶体积1000uL，得到浓度为1000pg/mL标准品母液。轻轻震摇至少5分钟，其充分溶解。每个稀释管中加入300uL稀释用缓冲液（1×）。将标准品母液参照下图做系列稀释，每管须充分混匀后再移液到下一管。没有稀释的标准品母液可用作标准曲线最高点（1000pg/mL），稀释用缓冲液（1×）可用作标准曲线零点（0pg/mL）。

二、操作步骤
1. 准备好所有需要的试剂和标准品；
2. 从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗涤液，静置浸泡30秒，弃掉洗液在吸水纸上将微孔板拍干，请立即使用不要让微孔板干燥；
4. 分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100uL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时;
5. 将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液300uL，然后将板内洗涤液吸去。重复操作3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最后一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；
6. 在每个微孔内加入100uL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时；
7. 重复第5步洗板操作；
8. 在每个微孔内加入100uLSA-HRP，室温孵育20分钟。注意避光；
9. 重复第5步洗板操作；
10. 在每个微孔内加入100uL显色液，室温孵育5-30分钟，注意避光；
11. 在每个微孔内加入50uL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；
12. 加入终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm或570nm作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；
13. 计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。若样本经过稀释，计算浓度时应乘以稀释倍数。

注：提供的标准曲线数据仅供参考，应根据同次试验所绘标准曲线计算样本含量。

三、试剂盒参数
1. 回收率：在细胞培养基样本中掺入不同水平的Mouse VEGF，测定其回收率。回收率范围在82-110%，平均回收率在94%。
2. 灵敏度：Mouse VEGF的最低可测剂量（MDD）一般小于1.8pg/mL。最低可测值是根据20个标准曲线零点吸光值的平均值加两倍标准差计算得到的相对应浓度。
3. 校正：此 ELISA 试剂盒经Sf21表达的高纯度重组Mouse VEGF蛋白所校正。
4. 线性：4个不同的样本中掺入高浓度的Mouse VEGF，然后用稀释剂（1×）将样本稀释到检测范围内，测定其线性。
5. 特异性：此ELISA法可检测天然及重组Mouse VEGF蛋白。将以下因子用稀释剂（1×）配置成50ng/mL的浓度来检测与小鼠VEGF的交叉反应。将50ng/mL的干扰因子掺入中间范围的重组小鼠VEGF对照品中，来检测对小鼠VEGF的干扰。没有观察到明显的交叉反应或干扰。

重组小鼠蛋白	重组人蛋白
VEGF R2/Fc Chimera	VEGF121
VEGF115	VEGF165
VEGF-B167	VEGF165/pIGF
VEGF-B186
VEGF-D

四、常见问题解析
1. 白板（显色完成后，无颜色出现）

序号	可能原因	解决方案
1	试剂盒储存不当；不同试剂盒试剂混用	购买新试剂盒，注意储存条件；不可混用
2	赋予温度低，时间短	如果温度偏低，则延长孵育时间喝显色时间
3	错加、漏加试剂	严格按照说明书步骤添加正确试剂
4	用于配置溶液的容器不干净，或水有问题	使用干净容器以及合格的蒸馏水
5	洗板过程中浸泡时间长，洗板次数太多，洗板冲击力大	严格按照说明书操作
6	试剂温度不均一	所有试剂要室温平衡30分钟
7	检测抗体和/或HRP浓度太低	参照说明书，不可随意稀释

2. 花板（空白、阴性阳性对照正常，但标本孔OD值明显偏高）

序号	可能原因	解决方案
1	洗涤次数少，不充分	按照说明书要求洗涤
2	底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）被金属离子或氧化剂污染或曝光	配制时使用干净容器以及合格的蒸馏水；避光保存
3	孵育温度高和/或时间过长	控制孵育和最后酶促反应的温度和时间
4	加样时未更换枪头，造成交叉污染	每个样都更换枪头
5	附近孔交叉污染	垂直拍板，使用合适的拍板纸，避免孔内进入纸屑
6	样本存在内源性干扰物质	推测可能的感染物质，并进行对应处理
7	样本溶血、贮存过久、凝集不全、被细菌污染、采血管中添加物影响	避免溶血、污染、过久储存等现象

五、实验流程图

血管内皮生长因子（VEGF或VEGF-A），又叫血管通透因子（VPF），是一种针对胎儿和成人的血管新生和血管生成的有效调节因子。血管内皮生长因子属于PDGF家族，该家族蛋白的特点是存在8个保守的胱氨酸结点和通过反向平行二硫键结合的二聚体（4）。经过选择性剪切，VEGF剪接体有不同的氨基酸长度。小鼠有VEGF120、VEGF164、VEGF188；人的VEGF有VEGF121、VEGF145、VEGF164、VEGF183、VEGF189和VEGF206。VEGF165是人的表达量最高、活性最强的一种亚型，其次是VEGF121和VEGF89。小鼠也许是同样情况。除VEGF120和VEGF121外，VEGF的其他亚型都含有基本的肝素结合区域，且不能自由扩散。小鼠VEGF164与相应的大鼠蛋白氨基酸享有97%的同源性;与人或猪的VEGF同源性为89%，与牛VEGF同源性为88%，与猫、马及犬的VEGF的同源性为90%。VEGF在多种细胞和组织中表达，包括骨骼肌和心肌细胞、肝细胞、成骨细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、角质形成细胞、棕色脂肪细胞、CD34+干细胞、内皮细胞、成纤维素细胞、血管平滑肌细胞等等。VEGF的表达受到缺氧和细胞因子的诱导，包括IL-1、IL-6、IL-8、抑瘤素M（oncostatinM）和肿瘤坏死因子α等。在发育过程和成体中，VEGF亚型的表达也是不同的。
VEGF的二聚体与两个相关的酪氨酸激酶受体相结合，即VEGFR1（也叫FLt-1）和VEGFR2（Flk-1/KDR）。VEGF与受体的结合可诱导后者同型二聚体化和自磷酸化。这些受体拥有7个胞外的类免疫球蛋白域。血管内皮细胞和一些非内皮细胞都有VEGF受体的表达。尽管VEGF与VEGFR1的亲和力最高，但VEGFR2却是调控VEGF的血管生产活性的主要因子。VEGF165也结合臂板蛋白（semaphoring）受体、神经纤毛蛋白1（neuropilin-1），由此促进与VEGFR2的复合体形成。
VEGF因其参与血管生成而著称。在胚胎发育过程中，VEGF调控内皮细胞的增殖、迁移和生存，并由此调控血管的密度、体积，但对于血管形成的格局并不起作用。VEGF通过成骨细胞和软骨细胞的招募促进骨骼的形成，它同时也是一个单核细胞趋化因子。在产后，VEGF维持血管内皮细胞的完整性,并且是大/小血管内皮细胞的有效丝裂剂。在成体中，VEGF主要在伤口修复和女性的生殖周期发挥作用。在疾病组织中，VEGF促进血管的通透性。因此，VEGF通过促进外渗和肿瘤血管生成，参与了肿瘤的转移过程。针对阻断VEGF活性的各种治疗策略正在被用于控制由VEGF诱导的肿瘤血管生成。体内循环的VEGF水平与自身免疫行疾病（如类风湿关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮）的病症程度相关。

未开封试剂盒，2-8°C储存。

1. 请在试剂盒有效期内使用。
2. 不同试剂盒及不同批号试剂盒的组分不能混用。
3. 样本值若大于标准曲线的最高值，应将样本用稀释剂（1×）稀释后重新检测；若细胞培养上清液样本需分布稀释，除最后一步用稀释剂（1×）稀释外，其它中间稀释可采用细胞培养基。
4. 检测结果的不同可由多种因素引起，包括实验人员的操作、移液器的使用方式、洗板技术、反应时间或温度、试剂盒的储存等。
5. 试剂盒中的终止液是酸性溶液，使用时请做好眼镜、手、面部及衣服的防护。
6. 仅供科研使用，不可用于体外诊断。