B cell growth factor 1, BCDF, B-cell stimulatory factor 1, BCGF1, BCGF-1, binetrakin, BSF1, BSF-1, IL4, IL-4, IL-4B_cell stimulatory factor 1, interleukin 4, interleukin-4, Lymphocyte stimulatory factor 1, MGC79402, pitrakinra,小鼠白介素4Elisa试剂盒

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗小鼠IL-4抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的IL-4与固相抗体和检测抗体结合，形成免疫复合物。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）。洗涤后，加入显色底物，避光显色。加入终止液终止反应，在450nm波长（参考校正波长540nm或570nm）测定吸光度值。

请在试剂盒有效期内使用

组成	规格	拆封后，稀释或重溶的试剂有效期
Mouse IL-4 Microplate	1块	将未使用的板条放回带有干燥剂的铝箔袋中密封后，可在2-8℃储存30天
Mouse IL-4标准品	2支	溶解后，计算用量分装，可在-20°C储存14天
Mouse IL-4检测抗体	1支	浓缩体积溶解后，可在2-8°C储存14天
40×SA-HRP	1支	40×浓度可在2-8°C储存；1×工作浓度不建议保存
10×浓缩稀释用缓冲液	1瓶	开封后，可在2-8°C储存30天
显色液	1瓶
终止液	1瓶
20×浓缩洗涤缓冲液	1瓶
封板膜	3张	常温储存，为避免污染，不可重复使用

15.6pg/mL-1000pg/mL

需自备试验器材
1. 酶标仪（可测量450nm检测波长的吸收值及540nm或570nm校正波长的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸头
3. 蒸馏水或去离子水
4. 洗瓶（喷瓶）、多通道洗板器或自动洗板机
5. 500mL量筒

一、实验前准备
1. 样品搜集及储存
①细胞培养上清：颗粒物应通过离心去除；立刻检测样本。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
②血清：使用血清分离管（SST）收集样本，样品室温放置30分钟。离心15分钟，转速为1000g。立即取出血清，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
③血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸作为抗凝血剂收集血浆，在收集后30分钟内离心15分钟，转速为1000g，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
2. 试剂配制（使用前请将所有试剂和样本放置于室温，静置 15 分钟。建议所有的实验样本和标准品做复孔检测）
①1×洗涤液配制：试剂盒中的浓缩洗涤液为20×母液，使用前需使用蒸馏水稀释为1×工作液。例：取10mL浓缩洗涤液+190mL蒸馏水定容至200mL，实际操作时可先计算使用量，再进行配制。
②1×稀释用缓冲液配制：试剂盒中的浓缩稀释用缓冲液为10×母液，使用前需使用蒸馏水稀释至1×工作液。例：取3mL浓缩稀释用缓冲液+27mL蒸馏水定容至30mL。实际操作时可先依据样本稀释倍数，计算所需的稀释用缓冲液用量，再进行配制。
③检测抗体：将干粉离心至管底，使用110uL稀释用缓冲液（1×）溶解，室温静置5分钟后得到100×母液；使用前需稀释为1×工作液。按照每孔用量100uL计算所需体积。例：使用了10个孔，则取10uL的100倍工作浓度的检测抗体，使用稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
④SA-HRP：SA-HRP为40×母液，使用前需使用稀释缓冲液（1×）稀释配制成1×工作液，每孔所需量为100uL。例：使用了10个孔，则取25uL的40×母液+975uL稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
⑤显色剂：按每孔100uL，计算当次试验所需要用量，取出相应体积的显色剂，避光；取出的显色剂仅供当日使用。
⑥标准品：冻干标准品用稀释用缓冲液（1×）重溶，重溶体积1000uL，得到浓度为1000pg/mL标准品母液。轻轻震摇至少5分钟，其充分溶解。每个稀释管中加入300uL稀释用缓冲液（1×）。将标准品母液参照下图做系列稀释，每管须充分混匀后再移液到下一管。没有稀释的标准品母液可用作标准曲线最高点（1000pg/mL），稀释用缓冲液（1×）可用作标准曲线零点（0pg/mL）。

二、操作步骤
1. 准备好所有需要的试剂和标准品；
2. 从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗涤液，静置浸泡30秒，弃掉洗液在吸水纸上将微孔板拍干，请立即使用不要让微孔板干燥；
4. 分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100uL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时;
5. 将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液300uL，然后将板内洗涤液吸去。重复操作3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最后一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；
6. 在每个微孔内加入100uL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时；
7. 重复第5步洗板操作；
8. 在每个微孔内加入100uLSA-HRP，室温孵育20分钟。注意避光；
9. 重复第5步洗板操作；
10. 在每个微孔内加入100uL显色液，室温孵育5-30分钟，注意避光；
11. 在每个微孔内加入50uL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；
12. 加入终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm或570nm作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；
13. 计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。若样本经过稀释，计算浓度时应乘以稀释倍数。

注：提供的标准曲线数据仅供参考，应根据同次试验所绘标准曲线计算样本含量。

三、试剂盒参数
1. 回收率：在细胞培养基样本中掺入不同水平的小鼠 IL-4，测定其回收率。回收率范围在75-112%，平均回收率在90%。
2. 灵敏度：小鼠 IL-4的最低可测剂量（MDD）一般小于2.3pg/mL。最低可测值是根据20个标准曲线零点吸光值的平均值加两倍标准差计算得到的相对应浓度。
3. 校正：此ELISA试剂盒经大肠杆菌表达的高纯度重组小鼠 IL-4蛋白所校正。
4. 线性：4个不同的样本中掺入高浓度的小鼠 IL-4，然后用稀释剂（1×）将样本稀释到检测范围内，测定其线性。

稀释倍数	平均值/期待值（%）	范围（%）
1：2	102	96-105
1：4	103	98-108
1：8	109	103-116
1：16	102	98-105

5. 特异性：此ELISA法可检测天然及重组小鼠 IL-4蛋白。将以下因子用稀释剂（1×）配制成 50ng/mL的浓度来检测与小鼠 IL-4的交叉反应。将50ng/mL的干扰因子掺入中间范围的重组小鼠 IL-4对照品中，来检测对小鼠 IL-4的干扰。没有观察到明显的交叉反应或干扰。

重组人蛋白

IL-4

IL-4R

四、常见问题解析
1. 白板（显色完成后，无颜色出现）

序号	可能原因	解决方案
1	试剂盒储存不当；不同试剂盒试剂混用	购买新试剂盒，注意储存条件；不可混用
2	赋予温度低，时间短	如果温度偏低，则延长孵育时间和显色时间
3	错加、漏加试剂	严格按照说明书步骤添加正确试剂
4	用于配置溶液的容器不干净，或水有问题	使用干净容器以及合格的蒸馏水
5	洗板过程中浸泡时间长，洗板次数太多，洗板冲击力大	严格按照说明书操作
6	试剂温度不均一	所有试剂要室温平衡30分钟
7	检测抗体和/或HRP浓度太低	参照说明书，不可随意稀释

2. 花板（空白、阴性阳性对照正常，但标本孔OD值明显偏高）

序号	可能原因	解决方案
1	洗涤次数少，不充分	按照说明书要求洗涤
2	底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）被金属离子或氧化剂污染或曝光	配制时使用干净容器以及合格的蒸馏水；避光保存
3	孵育温度高和/或时间过长	控制孵育和最后酶促反应的温度和时间
4	加样时未更换枪头，造成交叉污染	每个样都更换枪头
5	附近孔交叉污染	垂直拍板，使用合适的拍板纸，避免孔内进入纸屑
6	样本存在内源性干扰物质	推测可能的感染物质，并进行对应处理
7	样本溶血、贮存过久、凝集不全、被细菌污染、采血管中添加物影响	避免溶血、污染、过久储存等现象

五、实验流程图

白细胞介素4（IL-4），又称为B细胞刺激因子1,是一个约为18-20kDa的单体细胞因子，在免疫反应中呈多向性效应。小鼠IL-4的前体有140个氨基酸，包括一个20个氨基酸的信号肽和一个120氨基酸的成熟链。IL-4含有3个N链接糖基化潜在位点，3个链内二硫键，其结构为一个捆绑的四α-螺旋体。与人IL-4相似，小鼠IL-4有一个小的选择性剪切体。与人IL-4不同的是，此剪切体被认为表达很低，意义不大。成熟的小鼠IL-4氨基酸序列与人和大鼠IL-4分别有43%和63%同源性。研究显示，人、小鼠和大鼠IL-4的活性均属于种属特异性。IL-4由趋向Th2的CD4+T细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、NKT细胞、γδT细胞和嗜酸性细胞表达。
IL-4在2型免疫反应中起关键作用，能促进Th2分化和B细胞分泌免疫球蛋白G1和免疫球蛋白E亚型。IL-4通过结合I型或II型受体复合物引起Th2分化，该复合物含有分别与γ链或IL13Rα1偶联IL-4受体α亚基。通过细胞表面IL-4受体的异二聚体化，激活JAK族蛋白络氨酸激酶，引起其细胞质内C端磷酸化。从而引发STAT6的招募和磷酸化。随着STAT6的磷酸化、构象发生变化，导致STAT6的二聚体化、核转位、与靶基因DNA结合和转录激活，这些靶基因包括IL-4、IL-5、IL-13以及Th2特异性因子GATA3和c-Maf等。在功能上，IL-4促进小鼠B细胞增殖、生存和免疫球蛋白类转换为IgG1和IgE，促进肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的启动和趋化，促进幼稚CD4+细胞获得Th2表型，以及促进上皮细胞的增殖和活化。在肿瘤免疫学方面，IL-4也是一个重要细胞因子。在早期小鼠实验中，研究人员发现IL-4具有强大的抗肿瘤能力。小鼠排斥表达IL-4的肿瘤，形成长期的抗肿瘤免疫。这可能是由于IL-4具有抗血管生成作用或激活、选择CD8+T细胞的能力。不可理喻的是，新的证据显示IL-4是一个促肿瘤分子，因此IL-4是一个具有反向作用的细胞因子。可能的解释是，IL-4诱导肿瘤细胞中的抵抗凋亡分子上调，和CD8+T细胞中的溶细胞分子下调。另外，肿瘤产生的IL-4也被认为可作用于局部肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），从而诱导促进细胞迁移的组织蛋白酶的分泌。

未开封试剂盒，2-8°C储存。

1. 请在试剂盒有效期内使用。
2. 不同试剂盒及不同批号试剂盒的组分不能混用。
3. 样本值若大于标准曲线的最高值，应将样本用稀释剂（1×）稀释后重新检测；若细胞培养上清液样本需分布稀释，除最后一步用稀释剂稀释外，其它中间稀释可采用细胞培养基。
4. 检测结果的不同可由多种因素引起，包括实验人员的操作、移液器的使用方式、洗板技术、反应时间或温度、试剂盒的储存等。
5. 试剂盒中的终止液是酸性溶液，使用时请做好眼镜、手、面部及衣服的防护。