Caspase 3活性检测试剂盒(比色法)

产品简介：

Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用，其成员包括Caspase1～11等，均属于蛋白酶家族。Caspase 3又称CPP32、Yama、apopain、Caspase-3，属于CED-3亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3可以剪切procaspase 2、6、7和9，可直接特异性剪切许多caspase底物(如PARP、ICAD等)，并在细胞核凋亡过程中起到重要作用。

Jinpan Caspase 3活性检测试剂盒(比色法) (Caspase 3 Colorimetric Assay Kit)的检测原理是利用Caspase 3催化底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA)产生黄色的游离硝基苯胺pNA(p-nitroaniline)，通过分光光度比色法测定pNA在400～410nm处吸光值，从而间接获得caspase 3的活性。

 

产品组成：

编号 名称	C4911 50T	C4911 100T	Storage
试剂(A): 裂解缓冲液	10ml	20ml	4℃
试剂(B): 反应缓冲液	5ml	10ml	4℃
试剂(C): Ac-DEVD-pNA(2mM)	0.25ml	0.5ml	-20℃ 避光
试剂(D): pNA标准品(10mM)	0.05ml	0.1ml	-20℃ 避光
使用说明书	1份

 

自备材料：

可见光分光光度计配 100μl 比色杯，或酶标仪。最佳波长 405nm，也可测 OD400~450nm 但灵 敏度略降。

操作步骤：
一、组织细胞准备：
       Caspase活性测定值低，最常见原因是未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间点不恰当。 诱导凋亡时，并非剂量越大时间越长Caspase活性就越高。可设置不同剂量和时间点如0、2、4、8、 16、24小时，以检测最佳的观察点。通常2×107细胞或2mg组织裂解于1ml可产生1~3mg/ml蛋白。初 次测定时，单个测定反应可加~200μg蛋白物对应于2×106细胞或2个孔的6孔板细胞。最少，单个测定 反应需加20μg蛋白对应于2×105个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64和 leupeptin以免抑制Caspase活性。
1、（1）细胞裂解：1000g5分钟收集细胞，吸尽上清。每2~10×106细胞加50~100µl裂解液震荡裂解， 冰浴10分钟，再次震荡。
(2) 组织裂解：3~10mg组织加100µl裂解液放入小型玻璃匀浆器，上下匀浆30次。转移匀浆液于离 心管。
2、4ºC12,000g10分钟，取上清测定，或-70ºC保存。
3、蛋白定量：用Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1-3 mg/ml，相当于每10μl待测样品含10-30μg蛋白，否则应增加细胞用量。
二、测定pNA标准曲线：
1.用反应缓冲液稀释 10mMpNA 标准品为 200,100,50,25,12.5,6.25,3.125μM。设置不加 pNA 的 零管。
2.每一浓度取 100μl 加入 96 孔板或 100μl 比色杯，测定 405nm 吸光度 OD 值。
3.每一浓度标准管 OD405 值为 x 轴，对应的 pNA 浓度为 y 轴，用 Excel 制作 pNA 浓度对 OD405 值的标准曲线。
三、样品测定操作：
1.按下表设置 96 孔板反应体系。底物最后加入以使各管反应起始时间相同。设置不加样品的空白对 照管。酶活力不足或过高，可增加或减少样品。
2.盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37ºC反应2小时，肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2，此 时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失 去线性关系。
3.样品管OD405减去空白对照OD405，为样品Caspase水解底物产生的pNA吸光度。根据标准曲线计 算其含量，并以蛋白浓度校正之。
4.测得的Caspase酶活性表示方法有两种。
(1) Caspase活性增加的百分比：100%× 实验处理组OD/ 实验对照组OD，简单而可靠。
(2) 样品Caspase酶活力单位/mgprotein，精确但计算较复杂，参见说明。

反应体系参考表 (允许适当调整样品加样量）

 

	空白对照	高酶活性样品	低酶活性样品
反应缓冲液	95μl	85μl	60μl
待测样品	0μl	10μl	35μl
Ac-DEVD-pNA(2mM)	5μl	5μl	5μl
总体积	100μl	100μl	100μl

 

注意事项：

1.建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。

2.如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检测体积，尽量采用100μl体积以内的比色杯。

3.所测样本的值高于标准曲线的上限，应用裂解液稀释样品后重新测定。

4.样品蛋白有效含量过低或Caspase激活水平过低都会导致实际测得的A405过低，应注意使蛋白浓度尽量达到1～3μg/ml，调整诱导凋亡的时间和条件。

5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

产品说明：
1.Caspase酶活力单位定义：参考Chemicon公司Oneunitistheamountofenzymethatwillcleave1.0 nmolofthecolorimetricpNA-substrateperhourat37ºCundersaturatedsubstrateconcentrations。即当 底物饱和时,一个Caspase酶活力单位定义为37ºC1小时水解pNA底物，产生1nmol游离pNA。根据 pNA标准曲线和样品OD值，可计算出Caspase酶活力单位。
2. 除了处理组外，可设置阳性凋亡诱导剂组，阴性实验对照可包括不具有凋亡诱导作用的试剂(如 果能得到)处理组、溶剂对照组、或凋亡诱导零时间点。
 

有效期：12个月有效。