灵长类胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养基（无饲养层培养）

ReproFF2 

◆特点

●　一周只需处理细胞三次

●　只需常规培养基用量的一半

●　维持干细胞的未分化状态

●　维持干细的分化能力

注1）由于不含bFGF，请在培养人iPS/ES细胞时添加。

※保存温度：-20℃

※含有医药用以外的剧毒物0.0008％的2-巯基乙醇

 

◆优势

●　反复冻融的细胞依然保持存活。

●　具有长期培养核型稳定性。

●　转移培养基后细胞传代培养状态稳定。操作简便。

●　iPS细胞系菌落完整且免疫染色为阳性

◆产品概念：周末无需处理

 

◆无饲养层ReproFF2培养基对干细胞未分化状态的维持

维持人iPS细胞的未分化状态的培养

●　使用201B7株人iPS细胞

●　ReproFF2（无饲养层）培养：Passage 10.day 3

●　饲养层培养：Passage 48.day 3

 

1.菌落的形态和碱性磷酸酶活性的确认

　　图为使用ReproFF2无饲养层培养的细胞和有饲养层培养的细胞有着相似的菌落形态和碱性磷酸酶活性阳性。

 

　　把细胞移到ReproFF2培养基后，可能会出现细胞状态恶化的情况，但继续传代培养的话，状态就会稳定下来。

 

2.未分化标记物的免疫染色结果

　　用ReproFF2无饲养层培养的人iPS细胞和有饲养层培养的细胞相似，都能表达Oct3/4,Nanog,SSEA-1,TRA-1-60。

 

3.未分化标记物的FACS分析

　　用ReproFF2培养基无饲养层培养的人iPS细胞和有饲养层培养的细胞显示了相似的阳性率。

 

4.长期培养时核型的稳定性

　　对使用ReproFF2连续培养到第30代的人iPS细胞的核型进行分析。结果显示， ReproFF2培养基适合稳定长期的无饲养层培养。

 

5.人ES细胞的未分化维持培养

　　使用KhES-1株人ES细胞

　　使用ReproFF2无饲养层培养的人ES细胞显示为碱性磷酸酶染色阳性、Oct3/ 4阳性、未分化性得到良好的维持。

 

◆使用ReproFF2培养基培养人iPS细胞时，菌落状态不好的情况

　　ReproFF2虽然是适合培养人ES/iPS细胞的培养基，但是，根据培养操作等状况的不同，有时会出现菌落状态恶化的情况。

　　如出现以下所述的情况是没有问题的，请遵从下文指示放心继续培养细胞。

 

细胞移到ReproFF2培养基后菌落的形态

　　把细胞移到ReproFF2培养基后，可能会出现细胞状态恶化的情况（见下左图）。

　　继续进行传代培养的话，状态将会稳定下来（见下右图），请继续第4代的传代培养。

细胞移到ReproFF2培养基的第三天                  传代培养到第四代的第六天

（状态差的菌落）                                               （恢复状态的菌落）

使用ReproFF2培养基传代后的情况（传代时菌落太小的情况）

　　传代培养后，下左图的细胞可能是传代培养时菌落过小的情况。

　　解决方法：减少移液的次数或者降低移液管的强度。

  传代培养时，菌落太小　                           菌落在200-300um中传代培养

                                                                          （菌落大小恢复正常）

◆ReproFF2培养基无饲养层培养的人iPS细胞的分化能力

　　使用ReproFF2培养的人iPS细胞和有饲养层培养的细胞相似，都有向心肌细胞和神经细胞分化的能力。

 

人iPS细胞向心肌细胞的分化

　　把使用ReproFF2无饲养层培养的人iPS细胞向心肌细胞诱导分化，结果得到表达心肌标记物阳性的跳动心肌细胞团。

　　由此得出，使用ReproFF2无饲养层培养的人iPS细胞和有饲养层培养的细胞一样，拥有向心肌细胞分化的能力。

 

※α-MHC, Connexin-43, Cardiac Troponin T: 心肌标记物

人iPS细胞向神经前体细胞、神经细胞的分化

　　使用ReproFF2无饲养层培养的人iPS细胞向神经细胞诱导分化，形成玫瑰花结构（rosette），可以观察到βIII-tubulin的表达以及TH阳性的神经细胞。

　　由此得知，使用ReproFF2无饲养层培养的人iPS细胞和有饲养层培养的细胞一样，拥有向神经细胞分化的能力。

※βIII-tubulin：神经纤维的标记物

※rosette：神经前体细胞的标记物形态的特征
※TH (Tyrosine 3-Hydroxyrase)：多巴胺能神经元细胞的标记物

◆相关产品

产品编号	产品名称	规格
RCHEFM001	Freezing medium for human ES/iPS cells (25mL) 灵长类胚胎干细胞/诱导多能干细胞冻存液	25mL
RCHETP002	Dissociation solution for human ES/iPS cells (30mL) 灵长类胚胎干细胞/诱导多能干细胞分离液	30mL
RCHEMD007	ReproXF (500mL) 灵长类胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养基（无异源蛋白成分）	500mL
RCHEMD001	Primate ES cell medium (500mL) 灵长类胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养基（饲养层培养）	500mL

使用ReproFF2培养基的客户反馈

　　使用灵长类胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养基（ReproFF2）进行无饲养层培养。以下是使用ReproFF2培养基进行无饲养层培养目的的案例。

　　采用无饲养层培养，可消除饲养层细胞的污染，解决了用有饲养层的培养细胞研究带来的困难。

 

●　用于提取DNA/RNA，不受饲养层细胞的污染

●　用于再生医学研究

●　通过饲养层细胞消除抗分化作用

●　用于促进病毒感染

◆使用ReproFF2的培养结果

　　以下表格是客户使用ReproFF2培养基进行人类ES或iPS细胞培养的结果汇总。ReproFF2培养基已经在许多实验室成功应用于各种人类ES/iPS细胞系的研究。

结果汇总
机构名称	人类ES细胞系	培养基表面涂层	培养结果
京都大学前沿医学科学研究所干细胞研究中心	KhES-1	层粘连蛋白-5	Y
国立卫生研究所	KhES-3	基质胶	Y
东京大学医科学研究所干细胞与再生医学中心	KhES-3	基质胶	Y
庆应大学医学部生理学系	H9	基质胶	Y

 

◆使用ReproFF2培养人类iPS细胞系

使用ReproFF2培养人类iPS细胞系
机构名称	人类iPS细胞系	建立iPS细胞系方法	培养基表面涂层	培养结果
熊本大学分子胚胎学与遗传学研究所	201B7	血液透析滤过/逆转录病毒	基质胶	Y
国立卫生研究所	SeV-iPS	人脐静脉内皮细胞/仙台病毒	基质胶	观察到饲养层细胞的增殖
日本理化学研究所发育生物学中心	Line   1	–	起始细胞	Y
	Line   2	–	层粘连蛋白-5	Y（使用起始细胞时还观察到饲养层细胞的增殖）
	Line   3	–	层粘连蛋白-5	Y（细胞的附着不是很好，但是在有饲养层中难以保持分化的饲养层细胞系，也可以维持未分化状态）（使用起始细胞时还观察到饲养层细胞的增殖）
东京大学医科学研究所干细胞与再生医学中心	TkDA   3-4	血液透析滤过/逆转录病毒4	基质胶	Y
庆应大学医学部生理学系	201B7	血液透析滤过/逆转录病毒4	基质胶	Y

来自熊本大学分子胚胎学与遗传学研究所Nobuaki Shiraki博士（助理教授）的评价：

　　细胞系：201B7

　　“ReproFF2培养基非常有用，我们只需要隔天更换饲养层细胞和培养基的所需物质。反复冻融的细胞依然保持存活。使用ReproStem/小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基与ReproFF2培养基在基质胶进行细胞培养而产生的内胚层分化状态相似。”

日本理化学研究所发育生物学中心：

　　细胞系：内部建立的几种iPS细胞系。

　　“在有饲养层的培养中难以保持未分化状态的一些细胞系可以使用ReproFF2培养基维持。将有饲养层的培养的细胞转移到ReproFF2培养基中进行无饲养层培养，培养状态恶化，但传代后其培养状态恢复。操作程序不仅简单而且有几个小技巧，例如确保菌落的大小是否适合于传代。”

东京大学医科学研究所干细胞与再生医学中心：

　　细胞系：KhES-3、TkDA3-4（采用血液透析滤过与逆转录病毒转导建立）

　　“将有饲养层的培养的细胞转移到ReproFF2培养基中进行无饲养层培养过程中，产生一些实验错误是必然的，但是最后的培养结果是成功的。”

庆应大学医学部生理学系：

　　细胞系：H9, 201B7等

　　“对于任何细胞系来说，将有饲养层的培养的细胞转移到ReproFF2培养基中进行无饲养层培养操作比较简便。”

国立卫生研究所：

　　细胞系：KhES-3, SeV-iPS（采用仙台病毒转导进行人脐静脉内皮细胞建立）

　　“将有饲养层的培养的KhES-3细胞转移到ReproFF2培养基中进行无饲养层培养无任何困难。在SeV-iPS细胞系，我们观察到菌落周围有明显的分化细胞增殖。然而，在iPS细胞系菌落则完整且免疫染色表现为Oct3/4阳性。”