磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒BC0535
产品名称:磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒
产品型号:BC0535
产品特点:磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒测定意义:PFK(EC 2.7.1.11)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6二磷酸和ADP,是糖酵解过程的关键调节酶之一。测定原理:PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即
BC0535磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒的详细资料:
磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒
操作步骤:
一、样本的前处理
1、 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(10 4个)提取液体积(mL)为 500-1000: 1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或者 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5-10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3、 血清(浆)样品:直接检测。
二、测定步骤:
1. 分光光度计预热 30min 以上,调节波长 340nm,蒸馏水调零。
2. 样本测定(1) 在试剂二瓶中加入 17ml 试剂一和 1.13ml 蒸馏水充分溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其他物种)水浴 5 分钟。用不完的试剂 4℃保存一周。(2) 在试剂三中加入 1ml 蒸馏水充分混匀,冰上放置备用;用不完的试剂 4℃保存一周。(3) 在试剂四中加入 1ml 蒸馏水充分混匀,冰上放置待用;用不完的试剂 4℃保存一周。(4) 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 样本、10μl 试剂三、10μl 试剂四和 170μl 试剂二,混匀,立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 10min20s 后的吸光值 A2,计算ΔA=A1-A2。
磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒
PFK 活力单位的计算:用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
1、 血清(浆)PFK 活力的计算: 单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖 -1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK(U/mL)=[△A×V 反总÷(ε×d)×10 9] ÷V 样÷T=321×△A
2、 组织、细菌或细胞中 PFK 活力的计算: (1) 按样本蛋白浓度计算:单位的定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6- 二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK(U/mg prot)=[△A×V 反总÷(ε×d)×10 9] ÷(Cpr×V 样)÷T=321×△A ÷Cpr (2) 按样本鲜重计算单位的定义:每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK(U/g 鲜重)=[△A×V 反总÷(ε×d)×10 9] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T=321×△A ÷W (3) 按细菌或细胞密度计算单位的定义:每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK(U/10 4 cell)=[△A×V 反总÷(ε×d)×10 9] ÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.642×△A V 反总:反应体系总体积,2×10 -4L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×10 3L/mol/cm;d:比色皿光径,1 cm;V 样:加入样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
用 96 孔板测定的计算公式如下:
1 血清(浆)PFK 活力的计算: 单位的定义:每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖 -1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK(U/mL)=[△A×V 反总÷(ε×d)×10 9] ÷V 样÷T=642×△A 2 组织、细菌或细胞中 PFK 活力的计算: (4) 按样本蛋白浓度计算:单位的定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6- 二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK(U/mg prot)=[△A×V 反总÷(ε×d)×10 9] ÷(Cpr×V 样)÷T=642×△A ÷Cpr (5) 按样本鲜重计算单位的定义:每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK(U/g 鲜重)=[△A×V 反总÷(ε×d)×10 9] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T=642×△A ÷W (6) 按细菌或细胞密度计算单位的定义:每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK(U/10 4 cell)=[△A×V 反总÷(ε×d)×10 9] ÷(500×V 样÷V 样总)÷T=1.284×△A V 反总:反应体系总体积,2×10 -4L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×10 3L/mol/cm;d:比色皿光径,0.5 cm;V 样:加入样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;试剂一:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存。试剂三:粉剂×1 支,4℃保存。试剂四:液体×1 支,4℃保存